定义
Multiplexed protein imaging 是在 tissue section 上同时测量多个 protein markers，并保留每个信号空间位置的一类技术。多数流程会把图像分割为单细胞，再结合 marker expression 确定 cell phenotype 与 spatial neighborhood。
为什么重要
常规 immunohistochemistry 一次能观察的 markers 很少；flow cytometry 虽可测量更多 markers，却会丢失组织位置。Multiplexed protein imaging 把两者的部分优势结合起来，适合研究 cell-cell proximity、immune exclusion、tumour margin 与组织结构。
工作流程
典型流程包括 tissue staining、循环成像或 mass detection、image registration、background correction、cell segmentation、marker quantification、cell phenotyping 与 spatial analysis。最终结论不仅受抗体影响，也高度依赖 segmentation 和 phenotype threshold。
常见平台
- multiplexed immunofluorescence；
- CODEX；
- imaging mass cytometry（IMC）；
- multiplexed ion beam imaging（MIBI）。
能得到什么
- 单细胞或近单细胞分辨率的 protein expression；
- cells 在组织中的坐标；
- local neighborhoods 与 cell-cell proximity；
- tissue architecture 及 marker-defined functional states。
主要局限
Marker panel 通常预先定义，分子覆盖度远小于 transcriptome-wide assays，因此更适合验证已知 biology，而不是无偏发现未知 cell states。抗体特异性、批次效应、二维切片代表性和 segmentation error 都可能改变结论；空间接近也不自动等于 functional interaction。
相关术语
- spatial transcriptomics
- cell segmentation
- neighborhood analysis
- tissue organization
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阅读提示
读结果时先问：每个 phenotype 由哪些 markers 定义、是否允许 mixed states、segmentation 如何验证、分析单位是 cell、region 还是 patient，以及统计检验是否避免把大量 cells 当成大量独立患者。